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迪拜世博會(huì )丨大咖解讀下一代分子診斷技術(shù)：CRISPR/Cas系統
理想的病原體核酸檢測方式應該是準確、靈敏、快速、廉價(jià)、便攜，并且能在各種環(huán)境下對任何病原體進(jìn)行檢測。
理想的病原體核酸檢測方式應該是準確、靈敏、快速、廉價(jià)、便攜，并且能在各種環(huán)境下對任何病原體進(jìn)行檢測。近年來(lái)，基于成簇間隔的短回文重復序列及其關(guān)聯(lián)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas)的新型分子診斷工具，似乎具有成為這樣理想化核酸檢測平臺的潛力
下一代分子診斷技術(shù)！
從1987年首次發(fā)現CRISPR, 到最近幾年CRISPR-associated(Cas)技術(shù)的廣泛應用，以及2020年的諾貝爾化學(xué)獎頒給了CRISPR的發(fā)現者，CRISPR技術(shù)被譽(yù)為會(huì )改變和造福人類(lèi)的發(fā)明。短短幾年時(shí)間，CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門(mén)內容，被稱(chēng)為下一代分子診斷技術(shù)！
2020諾貝爾化學(xué)獎得主:
Emmanuelle Charpentier教授、Jennifer Doudna教授
而關(guān)于CRISPR技術(shù)在臨床領(lǐng)域及新冠檢測方面的應用，也成為了近期的討論熱點(diǎn)。中國科學(xué)院趙國屏院士、復旦大學(xué)附屬中山醫院胡必杰主任就在2020迪拜世博會(huì )中國館上海日《走近伯杰, 了解新冠抗疫中國方案、中國速度》專(zhuān)題直播中，圍繞著(zhù)新冠核酸快速檢測技術(shù)，帶來(lái)了關(guān)于CRISPR技術(shù)干貨滿(mǎn)滿(mǎn)的分享與討論。
從新冠核酸檢測說(shuō)開(kāi)去
在專(zhuān)題講座《速度為先 | 新冠核酸快速檢測技術(shù)的應用及展望》中，胡必杰教授提出對于現在新型冠狀病毒，國家提到了快速檢測，上海市自10月28日起，全市首批21家二級以上綜合性醫療機構面向市民提供24小時(shí)核酸檢測服務(wù)，爭取6小時(shí)出報告，對于現在新冠快速核酸檢測技術(shù)，與趙院士一起探討了值得期待和進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的技術(shù)和應用。
趙國屏院士以新冠為例，講到對于一個(gè)“好的”臨床檢驗產(chǎn)品，有5個(gè)關(guān)鍵要求：
第一，就是要正確，不能“錯怪好人”，不能出現“假陽(yáng)性；必須準確，不能“張冠李戴”，專(zhuān)一性、特異性要好。第二一定要靈敏，也就是說(shuō)不能“放過(guò)壞人”，不能出現假陰性。第三最好能夠“定量”。定量是確定檢測結果準確與否的重要佐證。第四，要快速，簡(jiǎn)便；第五成本要盡可能低。
胡必杰教授表示，趙院士提到的“不抓錯好人”、“不放過(guò)壞人”，同時(shí)定量，讓臨床醫生更加精準地去辨別是感染的病原體還是污染的病原體，同時(shí)簡(jiǎn)捷方便與價(jià)優(yōu)，是非常重要的。如果一項分子診斷技術(shù)非常昂貴，很多病人享受不到，只有達到以上五點(diǎn)要求，這項技術(shù)才能廣泛應用到臨床，最終讓老百姓和普通病人得益。
等溫擴增與CRISPR診斷技術(shù)的有機結合
而后趙院士提到，在過(guò)去幾十年的時(shí)間里，等溫擴增技術(shù)得到了極大的發(fā)展，現有也已經(jīng)開(kāi)發(fā)了很多種方法體系，包括經(jīng)典LAMP技術(shù)和RPA技術(shù)。等溫擴增有快速靈敏，對儀器要求低，是分子POCT診斷領(lǐng)域重要的技術(shù)力量。
第二項技術(shù)即是最近發(fā)展的CRISPR診斷技術(shù)。主流CRISPR診斷技術(shù)主要基于CRISPR-Cas12或Cas13來(lái)開(kāi)發(fā)，利用了Cas蛋白“反式切割活性”，可以將體系中的單鏈核酸高效的切割。
所以，CRISPR診斷的原理就是：當待檢體系中存在靶標核酸時(shí)，Cas蛋白在向導RNA的引導下特異識別靶標序列，形成復合物，進(jìn)而被激發(fā)出針對切割單鏈核酸的“反式切割活性“，將體系中的熒光標記探針切碎，發(fā)出熒光信號，完成檢測過(guò)程，通過(guò)檢測體系是否發(fā)光來(lái)判斷靶標核酸是否存在。
將恒溫擴增和CRISPR診斷技術(shù)結合起來(lái)，既可以利用恒溫擴增的快，靈敏和簡(jiǎn)便，又可以利用CRISPR的特異和靈敏，在進(jìn)行快檢的同時(shí)，既不用擔心檢測的假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題，也不用擔心PCR檢測中不確定的“灰區”問(wèn)題。
對于伯杰利用由其實(shí)驗室開(kāi)發(fā)的，吐露港公司授權的CRISPR診斷專(zhuān)利技術(shù)，成功開(kāi)發(fā)的國內首款CRISPR快檢一體機BG-Nova-X8，院士對其速度和通量表示了贊賞，認為儀器可以在30-40分鐘內完成24個(gè)新冠標本檢測，可以期待這個(gè)系統能夠為新冠快檢多做貢獻。
趙院士提到，未來(lái)技術(shù)的展望，等溫擴增的特異性和靈敏度都需要進(jìn)一步提升，可以通過(guò)和別的技術(shù)結合，“取長(cháng)補短”來(lái)提升檢測特異性和靈敏度，這一次伯杰將等溫擴增與CRISPR技術(shù)的嘗試，就是邁出了可喜的一步。
等溫擴增的一管多重問(wèn)題還需要創(chuàng )新的思路或者原理方面的突破，另一方面把恒溫擴增，CRISPR診斷技術(shù)，和數字PCR技術(shù)的絕對定量原理結合起來(lái)，來(lái)實(shí)現絕對定量，在未來(lái)有更多發(fā)展的可能性。
CRISPR技術(shù)的未來(lái)研究方向
可以說(shuō)，CRISPR/Cas系統毫無(wú)疑問(wèn)為感染性疾病的診斷提供了新的方法和契機，總結來(lái)說(shuō)，它具有如下優(yōu)點(diǎn)：
· 相較于基于PCR的傳統方法，毫不遜色的靈敏度和特異度
· 檢測所需時(shí)間短
· 簡(jiǎn)單便攜，不依賴(lài)昂貴的儀器和嚴苛的實(shí)驗環(huán)境
· 試劑耐受冷凍干燥，便于儲存和攜帶
· 標本前處理可以非常簡(jiǎn)單
· 結果讀取方便，能通過(guò)熒光或者肉眼讀取結果、
這幾大優(yōu)點(diǎn)使得CRISPR檢測平臺可以對病原體核酸分子實(shí)現實(shí)時(shí)快速檢測。根據以上的分析，未來(lái)CRISPR技術(shù)的兩大研究方向也初見(jiàn)雛形：
第一，是新的Cas蛋白的開(kāi)發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來(lái)發(fā)現的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅長(cháng)識別單鏈DNA，豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應”提供了方法。
第二，是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺結合起來(lái)，開(kāi)發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場(chǎng)效應晶體管，以及將Cas系統的報告探針固定于電極上，從而實(shí)現不需要使用信號擴增的電化學(xué)生物傳感器的構建。使用水凝膠作為其響應原件實(shí)現多樣化的信號輸出。與微流體技術(shù)結合開(kāi)發(fā)出的CARMAN技術(shù)，可以對數十個(gè)樣本，上百種病毒進(jìn)行快速檢測，為解決通量低的問(wèn)題提供了方法等。
不斷地將新興的材料與技術(shù)與CRISPR技術(shù)結合實(shí)現優(yōu)勢互補，開(kāi)發(fā)出更實(shí)用新穎的檢測策略用于感染性疾病診斷，將是未來(lái)一段時(shí)間內的研究重點(diǎn)。